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Utilizzo di approcci “omici” per lo studio dei meccanismi patogenetici alla base delle malattie neurodegenerative e del neurosviluppo, alla ricerca di biomarcatori e bersagli molecolari utilizzabili nella prognosi e nello sviluppo di terapie farmacologiche

Dott.ssa Tiziana Bachetti

Background

Le malattie neurodegenerative e del neurosviluppo, la cui eziologia può essere o prevalentemente genetica, o non genetica o multifattoriale, raggruppano un vasto numero di disordini che spesso condividono alterazioni molecolari aventi come conseguenza un danno irreversibile a livello neuronale. A supporto di questa considerazione è l’osservazione che la morte dei neuroni può essere il risultato proteine neuronali malfunzionanti che causano tossicità nel neurone stesso o a carico di altre cellule del sistema nervoso quali astrociti, oligodendrociti e microglia. E’ormai infatti ben delineata l’importanza del crosstalk tra le componenti cellulari neuronali e gliali del sistema nervoso, al fine di mantenere un’omeostasi funzionale che regoli la mielinizzazione dell’assone e un corretto turnover dei neurotrasmettitori, permettendo così che la trasmissione dell’impulso nervoso lungo l’assone e la comunicazione a livello delle sinapsi avvengano correttamente.
Ad oggi modelli cellulari e modelli animali di vertebrati, quali ad esempio zebrafish, hanno permesso di caratterizzare pathways coinvolti nell’insorgenza e nella progressione di queste patologie, elementi indispensabili per identificare e validare targets terapeutici al fine di sviluppare approcci mirati alla ricerca di farmaci specifici. In particolare, grazie alla trasparenza durante i primi giorni di vita embrionale e alla velocità del ciclo di riproduzione, zebrafish è un modello molto utilizzato per studi funzionali di proteine di fusione fluorescenti la cui espressione può essere così essere facilmente visualizzata e seguita durante le fasi di sviluppo, crescita e invecchiamento. Inoltre, approcci “omici” di ultima generazione, quali trascrittomica e proteomica differenziale, applicati a modelli cellulari e animali, hanno permesso di acquisire informazioni a larga scala sui pathways disregolati in diverse patologie del sistema nervoso, evidenziando differenze e somiglianze fondamentali per la conoscenza e l’identificazione di bersagli farmacologici, necessarie per sviluppare terapie specifiche per questa vasta classe di malattie. In particolare, la proteomica, grazie alla sua versatilità di applicazioni e utilizzo, si è rivelata un approccio di fondamentale importanza per la caratterizzazione di proteine sovra- o sotto-espresse in pathways coinvolti nel mantenimento dell’omeostasi neuronale.

Obiettivo/i di progetto

Obiettivi di questo lavoro saranno:

  1. Approfondimento dei meccanismi patogenetici alla base di malattie neuronali: in particolare mutazioni in geni espressi durante lo sviluppo verso la linea prevalentemente neuronale o espressi in cellule gliali verranno usate come modello per studiare i meccanismi cellulari alla base del difettivo sviluppo neuronale o della neurodegenerazione.
  2. Ricerca di biomarcatori prognostici: biopsie liquide e microvescicole circolanti nel sangue periferico potranno essere studiate per caratterizzarne il contenuto a fini prognostici.
  3. Ricerca di meccanismi alla base della variabilità fenotipica: approcci di biologia molecolare verranno applicati a modelli cellulari per indagare i meccanismi alla base di tale espressività variabile.

In particolare, dal punto di vista dei modelli, si procederà utilizzando:

  • Modelli in vitro: colture cellulari verranno utilizzati per analizzare le conseguenze molecolari delle mutazioni e nella comunicazione cellula-cellula; per la ricerca di farmaci efficaci nel recuperare la funzionalità delle proteine mutate mediante saggi di drug repositioning; per studiare i meccanismi di variabilità fenotipica, per studiare la neuroinfiammazione indagando il rilascio di citochine.
  • Modelli in vivo di zebrafish verranno analizzati mediante approcci di trascrittomica e proteomica classica, per valutare geni e proteine differentemente espressi in patologie neurodegenerative; approcci MALDI mass spectrometry imaging (MALDI-MSI) verranno utilizzati per caratterizzare la distribuzione delle proteine a livello tissutale, ad esempio per ricercare molecole infiammatorie nel sistema nervoso centrale.
  • Modelli ex vivo: cellule isolate da sangue di pazienti verranno analizzate mediante diversi approcci allo scopo di identificare marcatori molecolari di utilità nella prognosi delle malattie.

Metodologia

Le metodologie comprenderanno studi di epigenetica, regolazione trascrizionale, post-trascrizionale, tecnologie “omiche” quali analisi trascrittomica e proteomica convenzionale MS/MS e MALDI mass spectrometry imaging (MALDI-MSI) e approcci di biologia molecolare quali costruzione di minigeni, trasfezioni cellulari, saggi basati su molecole reporter, analisi di espressione genica mediante Real time PCR, analisi di proteine mediante Western blot, tecniche di imaging cellulare mediante microscopia a fuorescenza.
Verranno inoltre utilizzati i principali strumenti di biologia computazionale quali Gene Set Enrichment Analysis (GSEA), UniProt, The Human Protein Atlas, ToppCluster, WEB-based GEne SeT AnaLysis Toolkit (WebGestalt), per le ricerche in banca dati e per l’analisi dei dati ottenuti.

Impatto assistenziale certo o potenziale

L’integrazione dei risultati ottenuti con informazioni derivate da studi su diversi modelli, animali e cellulari, permetterà di ampliare le conoscenze sui meccanismi di base e di poter trasferire queste conoscenze in ambito farmaceutico, per lo sviluppo di terapie mirate a colpire vie di segnalazione malfunzionanti specifiche, in alternativa o come adiuvanti a cure sintomatiche attuate per molte di queste malattie.